HMGB1 ELISA
Features und Ressourcen

Zusammenfassung aus Kang R. et al.
"HMGB1 in Health and Disease", MolMed 2014;40:116

 

Einleitung

Der deutsche Zytologe Walther Flemming entdeckte 1879 die Chromosomen. Heute wissen wir, dass Chromosome alle notwendigen Gene enthalten, die für die Vererbung genau definierter Eigenschaften von den Eltern auf ihre Kinder notwendig sind. Chromosome sind eigentlich Pakete von dicht gepacktem Chromatin, einem Nukleoproteinkomplex.
 

Das exakte Zusammenspiel von DNA und chromosomalen Proteinen reguliert die Funktion, Struktur und Dynamik von Chromosomen, was wiederum Genomstabilität und Genregulation ermöglicht. Die chromosomalen Proteine kann man wieder in 3 Klassen unterteilen. Die erste und auch am häufigsten vorkommende Gruppe sind die Histone, die zweite Gruppe sind einige relativ wenig vorkommende gewebespezische, Harnstoff-unlösliche Proteine und die dritte, am zweithäufigsten vorkommende Gruppe sind die High Mobility Group Proteine (HMG). Im Gegensatz zu den Histonen sind die HMG Proteine evolutionär hochkonserviert und binden nur schwach ans Chromatin und zielen eher auf DNA-Strukturen als auf spezifische DNA Sequenzen.
 

Die Gruppe der HMG Proteine umfasst insgesamt drei Untergruppen, die Untergruppe der HMGA Proteine, der HMGN Proteine und die am häufigsten vorkommende Untergruppe der HMGB Proteine. Allen ist gemein, dass sie dem DNA-Remodeling dienen, indem sie mit Nukleotiden, Histonen, Transkriptionsfaktoren und anderen chromosomalen oder nukleären Proteinen interagieren.
 

Die Gruppe der HMGB Proteine umfasst letztendlich 4 Proteine: HMGB1, HMGB2, HMGB3 und HMGB4.
 

Das HMGB1 ist dabei das am weitesten verbreitete und am häufigsten vorkommende Protein (ca. 1 Mio Kopien/Zelle) dieser Gruppe. HMGB1 ist in höchstem Maße evolutionär konserviert und seine Entstehung lässt sich auf die Zeit vor der Trennung von Urmündern und Neumündern vor ca. 525 Millionen Jahren datieren. Homologe zum Säugetier-HMGB1 finden sich in Hefen, Fruchtfliegen, Zuckmücken, Stachelhäutern, Bakterien, Pflanzen, Fischen sowie Caenorhabditis elegans. Die Aminosäuren-Sequenz-Homologie bei Säugetieren beträgt dabei >99%.
 

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HMGB1 Funktion

Nukleäres HMGB1

Nukleäres HMGB1 dient als DNA Chaperon mit DNA-Bindungs- und –Faltungsaktivität und als Regulator verschiedener DNA-Schlüsselprozesse. Es sorgt für Nukleosom-Stabilität durch Bindung an Histone. Es reguliert die Nukleosom-Organisation aber auch deren Entwicklung. So haben HMGB1-Knockoutzellen bis zu 30% weniger Nukleosome. Weiterhin reguliert HMGB1 auch den Prozess der Nukleosom-Freisetzung. Eine weitere Rolle spielt das HMGB1 bei der V(D)J-Rekombination (auch somatische Rekombination genannt), einem Umlagerungsprozess von DNA bei Wirbeltieren, indem es an der Formation essentieller Proteinkomplexe involviert ist. HMGB1 ist auch in der Lage Transkriptionsraten und Genexpression durch verschiedene Mechanismen zu beeinflussen. Im Falle der DNA-Replikation ist das HMGB1 dadurch involviert, dass es die Aktivität der DNA-Polymerase reguliert. HMGB1 ist auch beteiligt an DNA-Reparaturprozessen, wie der Reparatur von DNA-Fehlpaarungen, Basen-Exzisionen, Nukleotid-Exzisionen und dsDNA-Bruch.
 

 

Abbildung 1: Funktionen von intra- und extrazellulären HMGB1
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Cytosolisches HMGB1

HMGB1 wird per Acetylierung vom Nukleus in das Cytosol transloziert. Normalerweise beträgt die Ratio dabei 30:1 von Nukleus zu Cytosol. Eine der Hauptaufgaben des cytosolischen HMGB1 ist die positive Regulierung der Autophagozytose. Autophagozytose-Stimuli sorgen für die Translozierung vom Nukleus zum Cytosol und anschließender Bindung an Beclin-1, um die Autophagozytose zu induzieren.
 

Membranständiges HMGB1

Membranständiges HMGB1 wurde bisher gezeigt beim Neuritenwachstum, der Thrombozytenaktivierung, des Reifungsprozesses roter Blutkörperchen, Zelladhäsion und der angeborenen Immunantwort. Bei der Thrombozytenaktivierung wird das HMGB1 pro-aktiv zur Membran transloziert und freigesetzt, um NET Formation und Funktion zu initiieren.
 

Extrazelluläres HMGB1

HMGB1 kann aktiv durch immunkompetente Zellen freigesetzt werden, aber auch passiv durch tote, sterbende bzw. verletzte Zellen. Extrazelluläres HMGB1 bewirkt vielfältige Aktivitäten und ist an vielen Prozessen, wie Entzündungen, Immunität, Zellmigration, -invasion, -proliferation, und –differenzierung, antimikrobieller Abwehr und Geweberegeneration beteiligt. Bis heute haben viele Studien gezeigt, dass das HMGB1 an multiplen Rezeptoren (z.B. RAGE und TLR’s) von aktiven Makrophagen, Monozyten, Neutrophilen, Fibroblasten und vielen anderen bindet, um die Cytokinproduktion (z.B. TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-6, IL-8, IL-10 u.v.a) zu induzieren.Die molekularen Mechanismen, die der proentzündlichen Aktivität des HMGB1 unterliegen sind u.a. der P38-, ERK-, JNK-, SIRT1- und NF-κB-Signalpfad, um nur einige zu nennen. Neutralisation von HMGB1 Freisetzung und/oder Aktivität (ST326052233) verringert die Entzündungsantwort. Die Immunabwehr besteht aus zwei Teilen, der angeborenen und der adaptiven Immunantwort und schützt den Organismus vor Pathogenen, Krebszellen und Fremdsubstanzen. HMGB1 spielt dabei eine wesentliche Rolle in der Regulierung beider Immunantworten. Bei der angeborenen Immunantwort kann das HMGB1 Makrophagen aktivieren oder inhibieren, je nach Lokalisation und Rezeptorpfad. Viele weitere immunkompetente Zellen, wie neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten, Mastzellen, dendritische Zellen, NK-Zellen, T-Zellen, B-Zellen und myeloide Suppressorzellen benötigen ebenfalls eine Aktivierung unter Beteiligung von HMGB1. Im Allgemeinen vermittelt HMGB1 zellmigratorische Stimuli über die RAGE-Achse. Es wurde schon gezeigt, dass HMGB1 Neuriten, glatte Muskelzellen, Myoblasten, Tumorzellen, Ito-Zellen aus der Leber, Stammzellen Endothelzellen u.v.m migrieren lässt.

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HMGB1 Modifikationen

1. Intranukleäre Modikfikationen

Die bekannteste HMGB1 Modifikation ist die Acetylierung. HMGB1 enthält zwei sogenannte „Nuclear Localisation Sites“ (NLS). Die Hyperacetylierung an diesen Positionen sorgt für die Translozierung in das Cytosol aus dem Zellkern heraus.
HMGB1 ADP-Ribosylierung wird vor allem bei Krebszellen beobachtet. Hyper-ADP-Ribosylierung von HMGB1 reguliert die Gentranskription herunter. Eine Poly-ADP-Ribosylierung vermittelt durch PARP1 ist jedoch auch nötig um HMGB1 Freisetzung aus der sterbenden Zelle, insbesondere bei der Nekrose zu orchestrieren.Verschiedene Mono-Methylierungen des HMGB1 wurden beachten in Neutrophilen und Nierenzelltumoren. Phosphorylierung des HMGB1 bestimmt dessen Fähigkeit DNA zu binden bzw. zu falten. Weiterhin bestimmt die Phosphorylierung ähnlich der Acetylierung dessen intrazelluläre Lokalisation. HMGB1 kann zusätzlich auch glycosyliert werden. Der Umfang ist jedoch äußerst gering und die Funktion der Glycosylierung bisher unbekannt.
 

Oxidation

 
HMGB1 current knowledge
Abbildung 2: HMGB1 Biologie nach dem heutigen Stand der Wissenschaft
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Für die Funktion des HMGB1 ist seine oxidativer Status entscheidend. Das Cytosol und auch das extrazelluläre Milieu sind im Gegensatz zum Zellkern oxidative Umgebungen. Für die Oxidation des HMGB1 sind dabei die drei Cysteine an den Stellen 23, 45 und 106 mit Ihren gebundenen Thiol-Gruppen entscheidend. Direkt nach der Freisetzung sind alle 3 Cysteine im reduzierten Thiol-Status. Diese HMGB1-Isoform wird als „fully-reduced HMGB1“ (REHM114-116) bezeichnet.
Aufgrund Ihrer sich gegenüberliegenden Position sind insbesondere die Cysteine C23 und C45 oxidationsanfällig, so dass diese sehr schnell eine Disulfid-Bindung aufbauen, während das C106 relativ stabil bleibt. Diese HMGB1 Isoform wird als „disulfide HMGB1“ (REHM120-122) bezeichnet. Eine vollständige Oxidation des HMGB1 bewirkt, dass alle drei Cysteine sulfoniert sind. Diese HMGB1-Isoform wird als „terminally oxidised HMGB1“ bezeichnet.
Der oxidative Status des HMGB1 bestimmt dabei nun seinen Funktionsmechanismus. Das fully-reduced HMGB1 hat eine chemotaktische Funktion und bewirkt die Migration von Immunzellen zur Gefahrenstelle hin. Das disulfide HMGB1 hingegen fungiert als pro-entzündliches Cytokin, indem es u.a. an den TLR4 bindet und die Produktion weiterer Cytokine, wie TNFα, IL-6, IL-10, induziert. Die genaue Funktion des terminally oxidised HMGB1 ist hingegen noch nicht ausreichend untersucht, wird aber im Allgemeinen mit der Beendigung eines Entzündungsprozesses in Verbindung gebracht.
 

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HMGB1 bei Erkrankungen

1999 beschrieben Haichao Wang und Kollegen weltweit das erste Mal das Auftreten von HMGB1 außerhalb der Zelle und seine Funktion bei der Sepsis. Sie zeigten, dass HMGB1 erst sehr spät von den Immunzellen, hier Makrophagen, nämlich ca. 20h nach LPS Aktivierung freigesetzt wird, um die angeborene Immunantwort herbeizuführen. Dies wurde in vielen späteren Studien bestätigt. Gleichzeitig zeigten Wang und Kollegen, dass eine weitere Gabe von HMGB1 für Sepsismodellmäuse tödlich ist, während die Neutralisation von HMGB1 (ST326052233) das Überleben sichert und dass bei Sepsispatienten tatsächlich HMGB1(ST51011) in der Zirkulation zu finden ist..
 

Bei Reperfusionsschäden in diversen Organen wurde gezeigt, dass das HMGB1 einer der Hauptauslöser dieser Schäden ist. Als Reperfusionsschaden versteht man den Prozess der Wiederkehr der Blutversorgung nach einer Ischämie in ein Gewebe, der einen sterilen Entzündungsprozess hervorruft.
 

Im Mausmodell für Reperfusionsschäden sind die HMGB1-Spiegel (ST51011) dabei schon eine Stunde nach der Reperfusion erhöht und persistieren auf diesem Level bis zu 24 Stunden danach. Ähnlich wie bei der Sepsis führt die Neutralisation von HMGB1 (ST326052233) zu einer erheblichen Verringerung des Reperfusionsschadens, während die Gabe von rekombinantem HMGB1 (REHM120-122) die Schäden erheblich verstärkt.
 

Im zentralen Nervensystem (ZNS) ist das HMGB1 verantwortlich für die Neuritenbildung. Im Gehirn sind ist die HMGB1 Expression am größten in jungen Erwachsenen und nimmt anschließend mit dem Alter ab. Als ein genereller Entzündungsmediator ist das HMGB1 auch für neuroinflammatorische Prozesse von Bedeutung. Dies betrifft eine Vielzahl von Erkrankungen des ZNS wie z.B. die Gesamtpalette der neurodegenerativen Erkrankungen, die motoneuronalen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen des ZNS, neuropathischem Schmerz und viele andere.
 

Im Herzkreislaufsystem spielt das HMGB1 eine Rolle bei diversen vaskulären Erkrankungen. Bei einem Herzinfarkt zeigt sich insbesondere die duale Rolle, die das HMGB1 spielt. Zum einen wird es benötigt für die Regeneration der Herzmuskulatur (REHM114-116), andererseits agiert HMGB1 (REHM120-122) als Cytokin, das den Entzündungsprozess und somit die Verletzung fördert.

Es gibt viele weitere Erkrankungen, in denen das HMGB1 eine entscheidende Rolle im Krankheitsverlauf spielt. Insbesondere Krebserkrankungen mit ihren vielfältigen Tumorarten sind hier zu nennen. Es sei hier nochmals auf die Publikation Kang R. et al. „HMGB1 in health and disease“ (Mol Aspects Med. 2014 Dec;40:1-116.) verwiesen.
 

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